摘要：
目的 本研究旨在探讨不同标准紫外分光光度法测定破壁灵芝孢子粉三萜含量的应用。方法 通过采用《中华人您共和国药典》、团体标准、保健食品标准与企业内部标准的紫外分光光度法，对破壁灵芝孢子粉三萜进行定量分析。结果4种研究方法中，三萜含量结果从高到低分别是企业标准17.9%、团体标准13.0%、《中华人您共和国药典》12.9%、保健食品标准5.7%。结论说明在实际应用中需要根据具体情况选择合适的标准，或建立更为准确和标准化的测定方法，以确保破壁灵芝孢子粉中三萜含量测定的准确性和一致性。
引言
灵芝孢子是灵芝的繁殖器官，含有丰富的多糖、三萜、甾体等活性成分。由于灵芝孢子具有坚硬的几丁质外壳,导致其内部活性成分难以被人体肠道吸收消化。研究显示,未破壁灵芝孢子粉人体吸收率仅为12%,而破壁后可达95%。因此,通过破壁处理将灵芝孢子转化为破壁灵芝孢子粉,能有效释放内部活性成分,提升其营养价值。三萜是灵芝的重要活性成分,具有抗癌、免疫调节、保肝及降血糖等多种药理作用,其含量是评价灵芝药用价值的重要指标。目前,三萜的测定方法尚未统一,主要依据《中华人民共和国药典》(下述简称《中国药典》)、团体标准T/FJHX0001—2022及保健食品相关标准,其均采用香草醛-冰醋酸-高氯酸显色法(以齐墩果酸或熊果酸为对照品),但测定结果存在较大差异。本研究通过对比不同标准及企业内部标准,从标准溶液配制、提取条件和反应参数等方面分析破壁灵芝孢子粉三萜含量测定的影响因素,旨在为建立更科学的质量标准及真伪鉴别提供参考依据。
展开剩余82%1.材料与方法
1.1实验试剂
原料:破壁灵芝孢子粉
甲醇、乙醇、冰乙酸、乙酸乙酯、三氯甲烷、高氯酸；香草醛；齐墩果酸标准品；熊果酸标准品
1.2仪器与设备
UV-1700紫外可见分光光度计；分析天平；可调氮吹仪；离心机；振荡器；超声波水浴锅；水浴锅。
1.3试验方法
1.3.1《中国药典》标准
称取齐墩果酸对照品适量,甲醇配成0.2mg/mL溶液。梯度取样于带盖试管,挥干放冷后,加新制香草醛-冰醋酸液0.2mL、高氯酸0.8mL,摇匀,70℃水浴加热15min,冰浴冷却5min,再加乙酸乙酯4mL摇匀,以试剂空白为参比,在546nm波长测定吸光度,绘制标准曲线。称取破壁灵芝孢子粉样品0.15g,加乙醇50mL超声45min,滤过,滤液转移至容量瓶,加乙醇定容至100mL,按《中国药典》方法测吸光度,从标准曲线读取齐墩果酸含量并计算三萜含量。
1.3.2团体标准
称取齐墩果酸对照品,用乙酸乙酯溶解并超声15min,制成0.1mg/mL溶液。梯度取样于试管,100℃水浴蒸干后,加0.2mL香草醛-冰醋酸液及0.8mL高氯酸,70℃水浴加热15min,冰浴冷却5min,再加4mL 乙酸乙酯摇匀,于546nm波长测定吸光度,绘制标准曲线。称取破壁灵芝孢子粉0.15g,置100mL容量瓶,加80mL无水乙醇超声30min,定容过滤得供试液。按团体标准法测吸光度,通过标准曲线计算三萜含量。
1.3.3保健食品标准
称取熊果酸对照品,加入乙酸乙酯溶解,按保健食品标准配制成标准溶液;同步制备破壁灵芝孢子粉供试液。梯度量取标准品于试管,60℃水浴蒸干后,加0.4mL5%香草醛-冰
乙酸溶液溶解残渣,再加1.0mL高氯酸混匀,60℃水浴加热15min,冰浴冷却后加5.0mL冰乙酸显色,于548nm波长测定吸光度绘制标准曲线。量取试样上清液1.0mL同法处理,根据标准曲线计算三萜浓度。
1.3.4企业内部标准
称取齐墩果酸对照品,称定后用甲醇溶解,梯度取样于带盖试管,挥干放冷,加入新配香草醛-冰醋酸液0.2mL及高氯酸0.8mL,70℃水浴加热30min,冰浴冷却5min,加乙酸乙酯4mL摇匀,以试剂空白为参比,在546nm 波长测定吸光度绘制标准曲线。称取破壁灵芝孢子粉 0.15g,加乙醇50mL,超声提取并滤过,滤液定容至100mL,按企业标准法测吸光度,通过标准曲线计算三萜含量。
1.3.5方法学验证
对比4种不同三萜测定方法的差异,考察标准溶液(对照品选择)、提取条件(溶剂类型、提取时间)及反应参数(显色温度、时间)等关键因素对测定结果的影响。
2.结果与分析
2.1不同测定方法三萜结果比较
采用《中国药典》、团体标准、保健食品及企业内部标准4种方法测定三萜含量,结果依次为12.9%、13.0%、5.7%和17.9%。其中,企业内部标准测定值最高,保健食品标准测定值最低。各方法显色反应条件如下:《中国药典》与团体标准均为70℃水浴15min;保健食品标准为60℃水浴15min;企业内部标准为70℃水浴30min。结果表明,在反应时间相同时,反应温度越高,三萜测定结果越高;在反应温度相同时,反应时间越长,三萜测定结果也越高。
2.2三萜不同测定方法的差异分析
4种方法均基于紫外分光光度法,通过化学显色反应原理,利用特定波长下的吸光度定量分析灵芝三萜含量。但各标准的操作细节存在差异(表1),主要体现为标准物质不同、溶剂挥发方式不同、显色反应的温度与时间不同。
2.3不同过滤方法对结果的影响
2.3.1滤纸与离心处理对结果的影响
采用1.3.3保健食品标准方法,分别对样品提取液进行滤膜(孔径0.22μm)过滤和6000r/min,离心10min处理。滤膜过滤后的提取液澄清透明,与标准溶液一致,三萜测定值为3.57%;离心处理后的上清液颜色浑浊,干扰显色反应,三萜测定值为5.70%。
2.3.2不同滤纸过滤对结果的影响
采用1.3.4企业内部标准方法,分别用GF/A滤纸、双圈定量滤纸、双圈定性滤纸过滤提取液。结果显示:GF/A滤纸滤液澄清透明,另两种滤纸滤液呈浅褐色(静置过夜后出现沉
淀)。3种滤液的三萜测定值分别为17.9%、17.8%、18.9%,差异较小,但滤液显色后与标准品色系不一致,推测滤纸过滤处理后的提取液可能存在非三萜物质,导致测定值偏高。
2.4同一测定方法不同标准物质的结果分析
采用1.3.3保健食品标准方法,分别以熊果酸和齐墩果酸作为标准品绘制标准曲线进行测定。结果显示(表2),10组数据的三萜平均值为3.8%,相对标准偏差为4.90%,单因素方差分析 P<0.5,表明两种标准品对三萜测定结果无显著影响。
2.5保健食品标准与企业内部标准组合试验分析
选取标准物质、溶剂挥发方式、显色条件均不同的保健食品标准与企业内部标准进行组合试验(表3)。结果显示,当标准溶液和样品提取步骤一致时,显色条件差异(70℃水浴30minvs.60℃水浴15min)导致三萜结果差异显著(方案一15.3%vs.方案二5.1%,差值10.2%;方案三16.0%vs.方案四4.0%,差值12%)。当显色条件和标准品一致时,样品提取方式对三萜结果影响较小(方案一与方案三差值0.7%,方案二与方案四差值1.1%)。说明显色反应温度及时间与三萜结果呈正相关。
3.讨论与结论
本研究采用4种紫外分光光度法测定破壁灵芝孢子粉的三萜含量,结果显示不同方法的测定结果存在较大差异,其含量由高至低依次为企业内部标准 (17.9%)、团体标准(13.0%)、《中国药典》(12.9%)、保健食品(5.7%)。在实际应用中,建议根据研究目的和实际条件选择合适的测定方法,并在必要时结合高效液相色谱法或液质联用法等其他技术手段进行结果验证,以消除测定结果的差异。
文章来源：宋利军,等:破壁灵芝孢子粉三萜含量紫外分光光度法测定的比较研究
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